低氧环境下骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：作为种子细胞来源的骨髓间充质干细胞移植后能否在相对缺氧的体内环境下生存，是移植成功与否的重要环节。因此研究体外低氧环境下骨髓间充质干细胞的生长状态，可以为体内细胞移植提供实验依据。

目的：观察体外低氧环境对大鼠骨髓间充质干细胞生长及血管内皮生长因子表达的影响。

方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，光镜观察细胞的形态；取第3代骨髓间充质干细胞，按氧浓度分为两组，分别在常氧条件下(体积分数为21%氧气)和低氧条件下(体积分数为3%氧气)培养72 h。用CCK-8法和流式细胞术检测两组细胞的增殖情况，Western-blot印迹法检测常氧组和低氧组细胞中缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子蛋白的表达。

结果与结论：①成功分离和培养了骨髓间充质干细胞，光镜下细胞呈长梭形，形态均一。②CCK-8法结果显示各时间点低氧组的细胞数目均高于常氧组，在36，48 h时活力增加显著(P < 0.05)。③流式细胞术结果显示，与常氧组比较，低氧组处于S期的细胞数量增加，且细胞增殖指数也显著增加(P < 0.05)。④Western-blot印迹法结果显示，常氧组细胞缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子蛋白仅有少量的表达，而低氧组两蛋白表达量均呈时间依赖性上调(P < 0.05)。以上结果说明低氧可诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞的增殖，又上调了缺氧诱导因子1α与血管内皮生长因子蛋白的表达，随着低氧时间的延长呈升高趋势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 低氧, 缺氧诱导因子1α, 血管内皮生长因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Whether transplanted bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic conditions can survive is crucial for the successful cell transplantation. Therefore, studies on the growth of bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic conditions in vitro can provide experimental evidence for in vivo cell transplantation.

OBJECTIVE: To observe the expression of vascular endothelial growth factor in bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxia.

METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were obtained and cultured, and observed under light microscopy. Passage 3 cells were cultured under normoxia (21% O₂) and hypoxia (3% O₂), respectively, for 72 hours. Then cell counting kit-8 assay and flow cytometry were employed to detect cell proliferation in the two groups. Western blot assay was adopted to detect the expression of hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in the two groups.

RESULTS AND CONCLUSION: (1)Rat bone marrow mesenchymal stem cells were obtained and cultured successfully, which were fusiform cells and had uniform shape under the light microscope. (2)The results of cell counting kit-8 assay showed that the number of cells in the hypoxic group was higher than that in the normoxic group at each time point, and cell viability increased significantly at hours 36 and 48 (P < 0.05). (3)The results of flow cytometry demonstrated that the proportion of cells in S phase and cell proliferation index in the hypoxic group were significantly increased, compared with the normoxic group (P < 0.05). (4)Western blot results showed that there was a small amount of the expression of hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in the normoxic group, but the expression of these two proteins in the hypoxic group was increased in a time-dependent manner (P < 0.05). These findings suggest that hypoxia can induce proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro, and also raise hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor expression in a time-dependent manner.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, anoxia, hypoxia-inducible factor, alpha subunit, vascular endothelial growth factors

中图分类号:

R394.2

郭辉，张于娟，魏晓光，徐彪，陈永珍. 低氧环境下骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3627-3632.

Guo Hui, Zhang Yu-juan, Wei Xiao-guang, Xu Biao, Chen Yong-zhen. Expression of vascular endothelial growth factor in bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3627-3632.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学变化 接种于培养瓶中的原代骨髓间充质干细胞培养24 h后镜下观察有大量悬浮的细胞，仅有少量贴壁细胞散在分布于培养瓶底(图1A)；随后6 d连续换液培养后发现悬浮细胞基本清除，只留下贴壁细胞，且贴壁细胞的数量随着培养时间的增加而明显增加，少量的贴壁细胞呈梭形、纺锤形(图1B)；7-10 d在培养瓶的边缘部有大量的梭形、纺锤形和多角形的贴壁细胞分布(图1C)；14 d可见单层细胞贴壁生长，细胞呈一定方向放射状或漩涡状排列，细胞基本上呈长梭形的成纤维细胞形态(图1D)。消化传代，24 h后传代细胞完全贴壁生长。

2.2 低氧诱导骨髓间充质干细胞的增殖情况 CCK-8结果显示，两组细胞在6-12 h均处于适应期，细胞数量缓慢的增加。常氧组细胞经过24-36 h快速增殖后，从48 h开始进入增殖平台期，而低氧组细胞的增殖活性在各个时间段内均高于常氧组，且在36 h和48 h细胞增殖更加明显，两者之间差异均有显著性意义(P < 0.05)；低氧组培养48 h后，细胞数量持续增加，且明显高于常氧组，至72 h未见明显的细胞数量减少(图2)。

2.3 低氧诱导骨髓间充质干细胞的细胞周期变化 流式细胞术结果显示，随着培养时间的延长，与常氧组比较，低氧组骨髓间充质干细胞的细胞周期有较为明显改变。在培养48 h和72 h后，低氧组处于S期的细胞比例和细胞增殖指数均增加更为明显，两者差异均有显著性意义(P < 0.05，图3)。

2.4 低氧对骨髓间充质干细胞中缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子蛋白含量变化的影响 Western-blot法结果显示，两组内参β-actin的表达比较一致，常氧组缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子仅有少量的表达，而低氧组在低氧的诱导下，缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子表达量均呈时间依赖性的上调，且在24 h时，缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达量均显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05，图4)。

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引言

材料方法

设计：分子水平、细胞水平体外观察。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年12月在苏州大学组织胚胎学实验室完成。

材料：

实验动物：Sprague-Dawley(SD)清洁级6月龄大鼠，雄性体质量260-300 g，雌性体质量230-250 g，由苏州大学动物科学研究中心提供，生产许可证号为SCXK(苏) 2007-0007，使用许可证号为SYXK(苏)2007-0035。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及体外扩增：SD大鼠颈椎脱臼法处死，体积分数为75%乙醇全身浸泡 10 min。无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，置于预先加入含有1%青链霉素PBS的培养皿中，去除两端骨骺，以无血清培养基反复冲洗骨髓腔至骨髓腔发白，收集骨髓悬液， 4 ℃离心8 000 r/min×30 min，弃上清液，加入培养基(L-DMEM/F12、体积分数为10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、酌加青霉素10×10⁴ U/L、链霉素100 g/L)，吹打成悬液，接种于细胞培养瓶内，24 h后首次半量换液。原代细胞贴壁充分，生长接近80%融合后，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化形成单细胞悬液，按照1∶3进行传代。

分组：取第3代骨髓间充质干细胞，按氧浓度分为两组，常氧组(体积分数为21%氧气)和低氧组(体积分数为3%氧气)，分别培养72 h。将低氧组细胞移入IG750三气培养箱中，37 ℃，体积分数为5%二氧化碳和体积分数为3%氧气条件下培养，常氧组在普通二氧化碳培养箱中37 ℃，体积分数为5%二氧化碳，体积分数为21%氧气条件下培养。

CCK-8实验：两组均选取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，待细胞达到80%融合后，消化细胞，制备成单细胞悬液。将细胞悬液以细胞密度为1×10⁴/孔，接种于96孔培养板内进行培养，将培养板分别置于常氧箱和低氧箱内，在6，12，36，48，72 h 5个时间点分别取8孔，加入10 mL的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响吸光度值的读数)，37 ℃孵育1 h，用酶标仪测定 450 nm处的吸光度，绘制出细胞的生长曲线。

流式细胞术检测细胞的周期：两组均在0，48，72 h消化收集细胞，先用PBS洗涤两三遍后，将4℃体积分数为70%乙醇缓慢加入，边加边摇，充分混合，将乙醇固定的细胞用PBS洗涤2遍，缓慢加入PI混合液(1 mL/管)，室温避光孵育30 min后，300目筛网过滤，上机检测。

Western blot实验：两组均在培养1，4，12，24 h分别取1.0×10⁷细胞，加入预冷裂解缓冲液500 μL，冰上匀浆、离心(4 ℃，12 000×g，30 min )后取上清，测量总蛋白浓度并调至同一水平，行聚丙烯酞胺凝胶电泳、转膜、奶粉封闭2 h、加入一抗(一抗分别为兔抗鼠缺氧诱导因子1α、血管内皮生长因子和β-actin多克隆抗体，均1∶1 000稀释) 4 ℃孵育过夜后，洗膜液清洗3次(每次10 min)、加入二抗(兔Ig G 1∶2 000)孵育1 h、洗膜液清洗(同上)，将EZ-ECL化学发光试剂的A液与B液以1∶1的比例混合后加在PVDF膜上，室温1 min后，UVP成像，分析灰度值。用同样的方法检测β-actin蛋白，UVP成像，分析灰度值。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞生长状况及形态特点。②骨髓间充质干细胞生长曲线。③骨髓间充质干细胞的细胞周期。④骨髓间充质干细胞中缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子蛋白的表达。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，所有数据均采用x(_)±s表示，采用两样本均数的Two-Way ANOVA 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前，虽然可以在肝脏、胚胎血、脐血中分离培养间充质干细胞，但是这类细胞的获得和研究主要集中在骨髓组织^[8-10]。目前体外获得间充质干细胞的方法主要有4 种^[11-12]，运用最多是密度梯度离心法和全骨髓法，前者是根据骨髓中细胞成分密度的不同，提取单核细胞进行贴壁培养；后者是根据干细胞的贴壁特性，定期换液除去悬浮细胞。流式细胞术和免疫磁珠分离法虽然可以获得较大浓度的间充质干细胞，但细胞易出现增殖缓慢等问题，在一定程度上限制了其广泛应用。因此本实验采用全骨髓法，通过多次换液和传代培养，除去悬浮细胞和贴壁能力较差的单核细胞，仅留下黏附性较强的间充质干细胞，进行培养扩增，为后续实验提供有力的保障。

氧气是保证哺乳动物细胞正常生长与分化的必需条件^[13]，也是细胞发挥生理功能的一种重要调节因素^[14]。体外常规细胞培养中常用的氧体积分数为21%，但体内氧体积分数明显低于体外的细胞培养环境，如骨髓中氧体积分数为4%-7%^[15]。有研究表明造血干细胞在缺氧环境中仍然可以维持其原始状态，缺氧可影响造血干细胞的造血功能^[16-17]。造血不同性质的造血干细胞在骨髓内沿着氧浓度呈梯度分布，在最缺氧(体积分数<1%氧气)处维持其原始干性，而活跃增殖分化的干细胞则分布在氧浓度为3%-7%的骨髓中线区域^[18-20]。骨髓间充质干细胞的生存环境与造血干细胞基本相同^[21-22]。

关于低氧环境下细胞的生长状态早有报道，有研究者采用体外低氧处理骨髓间充质干细胞24 h后，发现涉及细胞的生长、增殖和存活的约231种mRNA的表达变化^[23]。另有文献指出，体积分数40%的高氧却抑制人成纤维细胞的增殖，细胞端粒比常氧培养时缩短了4倍多。然而也有研究指出，低于1%氧气致使人细胞的增殖速度减慢，生长明显受到抑制^[24-26]。作为种子细胞来源的间充质干细胞在心肌梗死后或心力衰竭等状态下移植，能否在相对缺氧的体内环境下生存，这是移植成功与否的重要环节。因此实验观察了骨髓间充质干细胞在不同低氧时间点的生长情况、细胞周期等。结果发现，在低氧环境下的骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力，且有更快的生长速度。

缺氧诱导因子1α作为细胞对低氧适应性反应的上游关键性转录因子，对氧浓度的变化及其敏感，参与低氧诱导血管新生、细胞增殖和分化及细胞迁移等多种生理过程的调节^[27]。低氧环境下缺氧诱导因子1α的羟基化受到抑制，提高细胞内缺氧诱导因子1α浓度，缺氧诱导因子1α与缺氧诱导因子1β结合形成缺氧诱导因子1复合物，并识别相应低氧反应基因表达，从而启动细胞对低氧的反应^[28]。

Blancher等^[29]在采用氯化钴模拟的化学低氧培养骨髓间充质干细胞中发现缺氧诱导因子1α的表达量增加，培养液中细胞因子的表达量也相应的增加。本实验采用体积分数为3%氧气培养骨髓间充质干细胞24 h，结果发现低氧环境下，骨髓间充质干细胞内缺氧诱导因子1α蛋白的表达量呈时间依赖性上调；与常氧组比较，低氧组培养 24 h后，缺氧诱导因子1α蛋白表达明显增高。低氧激活了缺氧诱导因子1α信号通路，使骨髓间充质干细胞中缺氧诱导因子1α蛋白表达上调，而表达增加的缺氧诱导因子1α可能介导了细胞的增殖。近年来发现受缺氧诱导因子1α调控的靶基因有60多个，其中包括Epo、血管内皮生长因子、糖酵解酶、酪氨酸轻化酶等^[30]。

血管内皮生长因子是内皮细胞促有丝分裂因子和促通透性因子。实验证明在体外低氧环境下培养人胚肺细胞时发现缺氧诱导因子1α上调其靶基因血管内皮生长因子转录和表达，氧气是血管内皮生长因子基因表达最有力的调节者^[31]。Brogi等^[32]的研究结果也证实低氧不仅使血管内皮生长因子表达增加，也可通过旁分泌作用诱导血管内皮生长因子受体上调。

本研究发现常氧环境下体外培养骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子和缺氧诱导因子1α均有较微弱表达，提示细胞可通过自分泌方式获得两者的表达来介导相应的生理过程，而低氧环境下培养骨髓间充质干细胞，首先导致缺氧诱导因子1α蛋白水平的变化，同时由缺氧诱导因子1α调控的靶基因血管内皮生长因子的蛋白水平也提高，且二者的表达均呈时间依赖性上调，因此低氧可能是干细胞旁分泌的一种调控因素。低氧诱导的缺氧诱导因子1α蛋白的高表达，可能直接参与了骨髓间充质干细胞的增殖，且上调的缺氧诱导因子1α蛋白同时也激活了细胞核内血管内皮生长因子的表达，血管内皮生长因子蛋白的上调促进了细胞的迁移及局部血管再生能力。

总而言之，实验证实了骨髓间充质干细胞在低氧环境下增加缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子的表达，低氧可能通过缺氧诱导因子1α这条途径影响着细胞因子血管内皮生长因子的含量变化。实验模拟骨髓间充质干细胞移植体内环境中的存活及其部分机制为临床进行细胞移植治疗提供了实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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